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创新前沿赛默飞助力生物医药行业解决HCPs分析难题

发布:赛默飞世尔科技(中国)有限公司
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生物医药行业的技术盛会

7月17-19日,由中国药学会主办的“第七届中国药学会生物技术药物质量分析研讨会”盛大召开,来自生物医药及科研领域的多位专家及现场近300位行业人士相聚夏日炎炎的北京,共同探讨生物医药行业内的研究进展及前沿技术。

赛默飞色谱质谱生物制药业务发展经理唐恺带来《基于高分辨质谱平台的宿主细胞残留蛋白(HCPs)检测》的解决方案,助力生物医药行业解决HCPs分析难题。

赛默飞色谱质谱生物制药业务发展经理唐恺

 

什么是HCPs?为什么需要关注HCPs?

重组蛋白类药物是由遗传修饰的原核或真核宿主细胞培养/发酵产生,由于细胞凋亡/死亡/裂解,其他非必需蛋白质也可能释放到细胞培养基/发酵液中,因此残留在终产品中的其他蛋白质即为宿主细胞残留蛋白(HCPs)

 

HCPs的存在会影响药物的安全性和有效性,以及具有蛋白水解活性的HCPs影响药物产品的稳定性,因此生物医药公司不断优化其纯化工艺,从而控制终产品中HCPs的种类和含量

 

现有分析方法有哪些不足?

目前ELISA方法因其高灵敏度、高通量和易操作优势成为工业界的金标准,但仍存在很多限制。包括:

1.不能对HCPs进行精准鉴定,低丰度HCPs的检测易受限于高丰度蛋白的干扰;

2.定量动态范围(3个数量级)较低,抗体受限,开发周期长;

3.无法改变已有的方法,缺少校正标准限制定量的准确性,因此需多种检测方法相结合。

 

高分辨质谱技术的优势

随着高分辨质谱技术性能的不断提升,已具有高灵敏度和宽的定量动态范围,以及蛋白质组学技术的飞速发展,可实现对未知蛋白质的高通量定性和定量。

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基于nanoLC-MS/MS高灵敏平台的方法,如何对HCPs进行准确定性和相对定量呢?

一、样品前处理

2017年礼来制药公司Huang, Lihua, et al。在Analytical Chemistry杂志上发表中的方法是,以NIST抗体标准品为例,在蛋白质非变性的条件下进行酶切,抗体主成分被部分酶切,酶切后经90度高温变性,未被酶切的部分将被沉淀去除,从而提高HCPs的鉴定几率和方法的动态范围。

 

我们在此基础上进一步优化,缩短前处理时间提高工作效率,同时为考察此套流程对1-100ppm的HCPs的鉴定和相对定量能力,加入内标蛋白UPS2(48种蛋白,6个不同浓度)进行定性和相对定量。

图1.样品前处理流程示意图(来自Huang, Lihua, et al.)

 

二、仪器、色谱柱、数据分析软件

目前根据液相色谱的流速可分为纳升液相色谱(nanoLC,<1µL/min)、毛细管液相色谱(capillaryLC,1-1µL/min)、微流速液相色谱(microLC,10-100µL/min)、分析流速液相色谱(LC,>100µL/min),由于样品单位浓度和离子化效率依次下降,因此其灵敏度逐渐下降,本次实验采用灵敏度最高的纳升液相系统。

 

三、实验结果

1.定性结果:

内标蛋白UPS2中含有48种内标蛋白6个不同浓度,共鉴定其中24种,其实际含量结果如表1,含量范围为0。05-444。88ppm,实际含量>1ng(10ppm)的16种内标蛋白全部鉴定到,实际含量在0。06-0。38ng(0。6-3。8ppm)范围内共鉴定到6种,此方案的灵敏度足以满足生物药领域客户的需求。

(详细结果请见文末AN下载)

表1。本次实验中鉴定到UPS2内标蛋白的种类及其实际含量

 

2.蛋白相对定量结果:

本次实验进行HCPs的相对定量,采用蛋白TOP3的特异性肽段峰面积的平均值算法,得出每种蛋白的峰面积,经过三次技术重复,对特异性肽段大于等于1的蛋白峰面积进行统计,平均峰面积分布如图3A,峰面积大于1e的蛋白为此样品的主抗体,可看出本实验定量范围达6个数量级。UPS2内标蛋白的峰面积与绝对含量的分布如图3B,峰面积与绝对含量存在一定的线性关系, HCPs的相对含量可根据其峰面积进行初步判断,进而优化纯化工艺。

图3A。特异性肽段大于等于1的蛋白峰面积分布图

图3B.内标蛋白UPS2的峰面积(log2)与其绝对含量的分布

 

基于UHPLC-MS/MS平台的方法:

UHPLC-MS/MS对于低含量HCPs的检测时,需提高上样量(至少是纳升液相系统的50倍)以提高其灵敏度。

经实例验证此方法同样满足当前大部分需求,某抗体药物的HCPs经ELISA定量为5ppm,UHPLC-MS/MS能够准确鉴定到6种HCPs(unique peptides≥2),通过内标UPS2确定其检测限达1ppm,6种HCPs的相对含量在1-10ppm内。

 

小结

随着蛋白质组学的飞速发展,赛默飞Orbitrap高分辨质谱,可采用纳升液相,超高效液相两种方式,定性和相对定量分析HCPs,LOD均低至1ppm以下,为传统的ELISA方法补充更为丰富的信息,进一步帮助生物医药企业优化纯化工艺,监控终产品和过程产物中的HCPs含量。

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2019-07-22 10:41:51
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