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蛋白质印迹法样品制备

蛋白质印迹法(免疫印迹试验)就是Western Blot。作为一种实验方法。它常被用于分子生物学、生物化学和免疫遗传学中。生物组织样品或者凝胶电泳处理过的细胞经过特异性抗体着色,通过对着色的位置和着色深度的分析来使特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息获得。


样品制备

1、提取加药物处理的贴壁细胞总蛋白:

一些细胞因为受药物的影响脱落下来,因此还需要收集培养液中的细胞。

(1)在15ml离心管中倒入培养液,在2500rpm离心5分钟。


(2)弃上清,将4ml PBS加入,并且用枪轻轻吹打洗涤,然后2500rpm离心5分钟,弃上清后用PBS重复洗涤一次。


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(3)使用枪将上清洗干净之后,将100 μL裂解液(含PMSF)加入,在冰上裂解30分钟,为了使细胞充分裂解,裂解过程中要经常弹一弹。


(4)混合培养瓶中裂解液和裂解液,4℃、12000rpm离心5min,取上清,在0.5ml离心管中分装,并且保存在零下20摄氏度下。


2。提取组织中总蛋白:

(1)在1~2ml匀浆器中球状部位放置少量组织块,组织块使用干净的剪刀尽量剪碎。。


(2)在匀浆器中将400 μL单去污剂裂解液加入进行匀浆。然后在冰上放置。


(3)过几分钟,再碾一会儿在冰上放置,为了尽量碾碎组织,要重复碾几次。


(4)裂解30 分钟以后,就能够使用移液器往1.5ml离心管中移入裂解液。之后在4摄氏度下12000rpm离心5分钟,取上清在0.5ml离心管中分装并且保存在-20℃下。


3.提取单层贴壁细胞总蛋白:

(1)将培养液倒掉,在吸水纸上倒扣瓶,使培养液被吸水纸吸干。


(2)将3ml 4℃预冷的PBS(0.01M pH7.2~7.3)分别加入到细胞瓶中,平放轻轻摇动1分钟,对细胞进行洗涤,之后将洗液弃去,以上操作重复两次,一共洗三次细胞来使培养液洗去,弃净PBS后,在冰上放置培养瓶。


(3)裂解液每1毫升将10 μl PMSF(100mM)加入其中,摇匀在冰上放置。


(4)将400 μl含PMSF的裂解液分别加入到每瓶细胞中,在冰上裂解30分钟,应当经常来回摇动培养瓶,从而使细胞充分裂解。


(5)裂解结束以后,将细胞用干净的刮棒刮于培养瓶的一侧,然后用枪往1.5ml离心管中移入裂解液和细胞碎片。


(6)提前开离心机预冷,在4摄氏度下12000rpm离心5分钟。


(7)在多个0.5ml的离心管中分别移入离心后的上清,保存在零下20摄氏度下。


2019-08-29 17:31:35 浏览次数:86次

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